《2026年理想树图书高考必刷卷42套模拟卷汇编高中生物全一册通用版江苏专版》

23. (14分)小麦白粉病是因MLO基因存在而易被布氏白粉菌感染引起的一种常见病，该病会导致小麦严重减产。gRNA和Cas9蛋白可以共同作用于DNA的特定序列，对其进行剪切和修复，其中gRNA识别DNA；Cas9蛋白剪切DNA。科研人员利用农杆菌转化法，将gRNA和Cas9蛋白的基因导入小麦中，对MLO基因进行改造，使其无法发挥作用。基因表达载体的构建如图1所示，其中LB、RB分别为农杆菌中T-DNA的左、右边界，在最终载体的T-DNA中启动子均为真核基因启动子，T-DNA以外区域的基因启动子均为原核基因启动子，图2为几种限制酶的切割位点。据此回答下列问题：

(1)Cas9蛋白的作用类似基因工程中的限制酶，Cas9蛋白通过催化磷酸二酯键的断裂发挥作用。
(2)将gRNA和Cas9蛋白的基因插入Ti质粒的T-DNA中的原因是农杆菌侵染植物后，T−DNA能整合到植物细胞的染色体DNA上。(2分)将载体1和载体2构建成最终载体所用的限制酶为SpeI和NheI。最终载体中gRNA基因还可能位于启动子a、b之间，选用图1中F1、F4作引物进行PCR可以判定其拼接位置。(2分)
(3)最终载体除图1中元件外，还应具有复制原点、终止子(填写两种)元件。图中gRNA和Cas9蛋白基因转录时模板链为DNA的两条不同单链。(填“DNA的同一条单链”“DNA的两条不同单链”或“DNA的任意单链”)
(4)导入最终载体后，对农杆菌和小麦细胞进行筛选，需要培养基中分别添加卡那霉素、潮霉素。(2分)从个体水平上验证小麦的MLO基因改造成功的方法是用布氏白粉菌感染转基因小麦，小麦不出现白粉病。(2分)

答案：
23.(除标注外，每空1分，共14分)
(1)限制 磷酸二酯(2分)
(2)农杆菌侵染植物后，T−DNA能整合到植物细胞的染色体DNA上(2分) SpeI和Nhe| F1、F4(2分)
(3)复制原点、终止子 DNA的两条不同单链
(4)卡那霉素、潮霉素(2分) 用布氏白粉菌感染转基因小麦，小麦不出现白粉病(2分)
重难考点 基因工程及其应用
[深度解析]
(1)Cas9蛋白对DNA特定序列进行剪切，作用类似基因工程中限制酶；通过催化磷酸二酯键的断裂发挥作用。
(2)农杆菌侵染植物后，T−DNA能整合到植物细胞的染色体DNA上，可以通过将gRNA和Cas9蛋白的基因插人Ti质粒的T−DNA中从而导入植物细胞。拼接时，通过限制酶SρeI和NheI将载体1的gRNA和启动子a剪切，该片段两端的黏性末端相同，用SρeI将载体2切开，通过DNA连接酶将该片段(gRNA和启动子a)连接到载体2上可能得到最终载体。因为从载体1切下的片段(gRNA和启动子a)两侧黏性末端相同，在构建最终载体时可能会反向连接，用F1、F4(或F2、F3)进行PCR能扩增出正向连接产物而不能扩增出反向连接产物。因此选用图中F1、F4(或F2、F3)作引物进行PCR可以判定其拼接位置。
(3)基因表达载体除了图1中所示的目的基因、启动子、标记基因外，还应具有复制原点、终止子等元件。图中gRNA和Cas9蛋白基因的启动子方向不同，因此转录时模板链为DNA的两条不同单链。
(4)导人最终载体后，对农杆菌进行筛选，需要利用能在原核细胞中表达的标记基因，所以在培养基中添加卡那霉素以确定是否导入了载体；对小麦细胞进行筛选，需要利用在真核细胞中表达的标记基因，所以培养基中添加潮霉素以确定T−DNA是否导人小麦细胞。从个体水平上验证小麦的MLO基因改造成功可以用布氏白粉菌感染转基因小麦，小麦不出现白粉病，说明改造成功。
归纳总结 基因表达载体需要具备的基本条件