《2026年理想树图书高考必刷卷42套模拟卷汇编高中生物全一册通用版江苏专版》

24. (12 分)A 蛋白是某种激素合成的关键酶。为鉴定该激素合成的部位及生理作用，科研团队利用无缝克隆技术将 A 蛋白结合蛋白基因(P 基因)与葡萄糖苷酶基因(GUS 基因)融合，构建 A 蛋白检测探针，通过农杆菌转化法导入拟南芥进行实验。相关原理、过程及质粒的结构如图所示。请分析回答：

(1)无缝克隆原理图中，过程①中 T5 核酸外切酶沿5′→3′的方向水解 DNA，其目的是形成黏性末端过程③所需的酶有DNA聚合酶、DNA连接酶。
(2)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术可实现多个片段的连接，且操作时间短、成功率高。某无缝克隆线上设计软件强制输入片段的长度必须大于 75 bp，并提示最好不低于 110 bp。请推测无缝克隆技术不适合连接小于 50 bp 小片段的原因：小片段可能会被T5核酸外切酶彻底降解。
(3)图中利用无缝克隆技术构建 GUS-P 融合基因的关键是引物 R1 与引物R2的5′端序列互补。
(4)图中利用双酶切法将融合基因插入 Ti 质粒，应选用的限制酶为SmaⅠ、BclⅠ。扩增 GUS-P 融合基因所需的引物 R1 序列($5^\prime \to 3^\prime$)的设计依据为bc(填序号：a. 同源序列 b. 限制酶的识别序列 c. P 基因的部分序列 d. GUS 基因的部分序列)。据图分析，引物 R1 和 F2 应分别为下列引物②③(填序号，2 分)。
①$5^\prime$-TAAGTTGTCT……-3'
②$5^\prime$-CTTGGATGAT……-3'
③$5^\prime$-TCTGTTGAAT……-3'
④$5^\prime$-ATTCAACAGA……-3'
(5)利用农杆菌转化法将目的基因导入拟南芥细胞后，进行植物组培，用草甘膦对组培苗进行筛选。已知葡萄糖苷酶可以水解 X-Gluc 呈蓝色，将转基因拟南芥置于不同培养液中培养一段时间，然后分离不同部位的组织分别加入 X-Gluc 进行鉴定，结果如表所示：

根据上表实验结果分析，该激素最主要的合成部位是根，该激素的生理作用是调节植物生长，使植物适应缺磷环境。

答案：
24.(除标注外，每空1分，共12分)
(1)5′→3′ 黏性末端 DNA聚合酶、DNA连接酶
(2)小片段可能会被T5核酸外切酶彻底降解
(3)引物R2的5′端序列 ②③(2分)
(4)SmaⅠ、BclⅠ bc ②③
(5)草甘膦 根 调节植物生长，使植物适应缺磷环境
热门考点基因工程的原理及操作过程、PCR技术
[深度解析]
(1)由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5′→3′的方向水解DNA，以形成黏性末端。过程③缺口处DNA链的补齐，可以看作DNA片段的复制和连接过程，所需的酶有DNA聚合酶(常考点:DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到子链的3′端)和DNA连接酶。
(2)无缝克隆技术不适合连接小于50bp的小片段，原因可能是小片段容易被T5核酸外切酶彻底降解，无法进行下一步操作。
(3)由题图可以看出，P基因的引物为F1和R1，GUS基因的引物为F2和R2，二者相连的方式是GUS基因的右端(引物R2)与P基因的左端(引物F1)相连，DNA的两条链是反向平行的，所以用无缝克隆技术构建GUS-P融合基因的关键是引物F1(3′端序列)与引物R2的5′端序列互补。

所以需F1与R2部分碱基互补
(4)利用双酶切法将GUS-P融合基因插入Ti质粒的T-DNA区，如果使用BamHⅠ和SmaⅠ，会同时切断抗性基因Tetʳ和抗性基因Ampʳ，且其有一个切点是位于T-DNA的外部，故只能选择BclⅠ和SmaⅠ。R1作为扩增P基因的引物，无缝克隆之后在GUS-P融合基因的最右侧，需要用限制酶切后与质粒相连，所以扩增GUS-P融合基因所需的引物R1序列应与放线菌序列的3′端互补配对，序列为③5′-TCTGTTGAAT……-3′，F2的序列需要与放大序列的互补链的3′端互补配对(即与放大序列的5′端相同)，分析可知引物F2的序列为②5′-CTTGGATGAT……-3′，因此选用的引物组合为②③。
(5)利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、拟南芥细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是先筛选出能在含四环素培养基上生长而不能在含氨苄青霉素培养基上生长的农杆菌，即为转基因成功的农杆菌，农杆菌的Ti质粒只有T-DNA可整合到受体细胞的染色体DNA上，T-DNA携带的抗性基因为抗草甘膦基因，所以再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的拟南芥细胞。葡萄糖苷酶可以水解X-Gluc呈蓝色，根据表格可知，在完全培养液中，根呈现蓝色，茎和叶呈现浅蓝色，说明该激素最主要的合成部位是根;与完全培养液相比，在缺磷培养液中，根的颜色变为深蓝色，表明在缺磷条件下根部GUS基因高表达，由于GUS-P融合基因一起表达，所以在缺磷的培养液中，根部P基因也高表达，说明该激素的生理作用是调节植物生长，使植物适应缺磷环境。