《2026年高考领航卷生物》

21. (12分)如图表示利用大肠杆菌生产干扰素的部分操作，质粒A中的lacZ基因可用于“蓝白斑”筛选。lacZ基因的表达产物β - 半乳糖苷酶可分解无色化合物X - gal而使菌落显蓝色，不含lacZ基因的菌落则呈白色。回答下列问题：


(1)采用PCR技术扩增干扰素基因时，在反应体系中除加入引物、dNTP、缓冲液、Mg²⁺外，还需要加入干扰素基因、耐高温的DNA聚合酶。测得干扰素基因非模板链的部分序列为5' - ATCTACGCGCTCATCCG……CGCAGCAATGAGTAGCG - 3'。科研小组尝试设计了如下4种引物，其中适合用于扩增干扰素基因的一对引物是②④(选填序号)。
①5' - GACTACTCGCGCATCTA - 3' ②5' - ATCTACGCGCTCATCCG - 3'
③5' - CGCAGCAATGAGTAGCG - 3' ④5' - CGCTACTCATTGCTGCG - 3'
(2)为了使质粒A和干扰素基因能正确连接构建重组质粒B，设计干扰素基因的引物时在两种引物的5'端分别添加限制酶BamHⅠ、SmaⅠ的识别序列，且选用限制酶BclⅠ、SmaⅠ切割质粒A，酶切后的质粒A和干扰素基因片段通过T4(填“E. coli”或“T4”)DNA连接酶作用后获得重组质粒。
(3)若干扰素基因与质粒A正确连接，则图中重组质粒B上M处的部分序列是5' - TGATCCATCTACGCG - 3'。
(4)为了达到筛选目的，根据所用载体质粒的遗传特性，受体大肠杆菌需具备氨苄青霉素敏感和β - 半乳糖苷酶缺陷等特征。筛选时，将转化后的菌液经稀释后接种于含氨苄青霉素和X - gal的培养基上，经培养后挑取白色的单菌落，即为目标工程菌。

答案：
21.【参考答案】 (除标明外，每空1分)
(1)干扰素基因、耐高温的DNA聚合酶 ②④(2分)
(2)5' BamHⅠ、SmaⅠ BclⅠ、SmaⅠ T4
(3)TCCATCTAC(2分)
(4)氨苄青霉素 β - 半乳糖苷酶 氨苄青霉素和X - gal
【评分标准】
(1)第一空答全得分，答“模板、TaqDNA聚合酶”也可得分；第二空2个都正确才得分。
(2)第二、三空答全得分；第四空不用题中所给备选内容作答不得分。
(3)第二空答“lacZ基因”也可得分；第三空答全得分。
【解题思路】 基因工程
(1)PCR反应体系中含有DNA模板、引物、dNTP、缓冲液、Mg²⁺、耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）。非模板链与模板链碱基互补配对，DNA聚合酶从引物的3'端开始延伸子链，据此分析设计的引物序列（如图）。
(2)为使图中质粒A和干扰素基因正确连接构建重组质粒B，设计干扰素基因的引物时，应在两种引物的5'端添加合适的限制酶识别序列。分析质粒A的结构，为了不破坏标记基因和复制原点，不能选择BamHⅠ、EcoRⅠ，可用BclⅠ、SmaⅠ切割质粒A；分析干扰素基因的结构，不能选择BclⅠ；结合表格中的限制酶识别序列可知，BclⅠ与BamHⅠ切割后形成的黏性末端相同，故可在干扰素基因两侧添加BamHⅠ、SmaⅠ的识别序列，同时需要选用BclⅠ、SmaⅠ切割质粒A。由于SmaⅠ切割后形成平末端，因此通过T4DNA连接酶连接后获得重组质粒。
(3)根据重组质粒B中的转录方向（顺时针）可确定干扰素基因从M端向N端转录，在引物②的5'端应添加BamHⅠ的识别序列。分析切割与连接过程如图所示。

BclⅠ切割质粒A BamHⅠ切割目的片段 干扰素基因
5'—TGATCA CGATCCATCTACGCG···非模板链
3'—ACTAGT CCTAGGTAGATGCGC···模板链
连接 转录方向
质粒B的M处部分序列
5'—TGATCCATCTACGCG—3'
(4)重组质粒B携带氨苄青霉素抗性基因，为筛选出成功转入重组质粒B的大肠杆菌，受体菌需为氨苄青霉素敏感型。重组质粒B的lacZ基因被破坏，会使菌落呈白色，为筛选出成功转入重组质粒B的菌落，受体菌需为lacZ基因缺陷型，无法自主合成β - 半乳糖苷酶。
高分技法 构建基因表达载体时选择限制酶的原则
(1)不能破坏目的基因。
(2)不能破坏载体上的标记基因、启动子、终止子、复制原点。
(3)确保出现相同末端。为避免限制酶切割后目的基因和载体自身环化和随意连接，可使用两种限制酶同时切割含目的基因的片段和载体。
(4)确保酶切后目的基因能够插入载体的启动子和终止子之间。