《2026年理想树试题攻略高中生物》

25. (12分)2,3-丁二醇是一种在食品工业、医药行业等诸多领域具有广泛应用价值的化合物,常用产气肠杆菌进行生产。产气肠杆菌发酵产生2,3-丁二醇的同时,也会生成乳酸、甲酸、乙酸等多种副产物,影响产量。已知P基因(位于拟核DNA分子中)与产气肠杆菌发酵过程中副产物的生成有关,研究人员欲利用生物技术敲除P基因以获得高产2,3-丁二醇的产气肠杆菌。
(1)利用PCR技术扩增含有P基因上游片段和下游片段序列的融合片段N时,复性温度下发生的过程是两种引物分别与N的两条单链结合。PCR产物常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
(2)融合片段N两端的酶切位点如图甲所示,为使融合片段N定向插入质粒中,应选择图甲中的限制酶$BamH$Ⅰ和$Spe$Ⅰ对质粒A(长度为2 800 bp)进行完全酶切,利用DNA聚合酶将质粒特定的黏性末端补平后,在DNA连接酶的作用下可获得含有融合片段N的重组质粒B。已知限制酶SmaⅠ和BamHⅠ两酶切位点之间的序列长度为600 bp,用限制酶SmaⅠ和BamHⅠ对重组质粒B进行完全酶切后,电泳可得到1条条带。


(3)将重组质粒B导入用$Ca^{2 +}$处理的产气肠杆菌细胞中,利用重组质粒B和产气肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理,对P基因进行敲除(如图乙),敲除后的P基因将被有关的酶降解。P基因敲除过程中,可发生多种形式的同源区段交换,交换后,用图乙中的引物1和2进行PCR扩增,检测结果如图丙所示,其中菌落④(填序号)为P基因敲除株,出现菌落③的原因可能是重组质粒B通过同源重组整合到了产气肠杆菌的基因组中。

答案： 25.(除标注外，每空1分，共12分)
(1)两种引物分别与N的两条单链结合　琼脂糖凝胶电泳
(2)$BamH$Ⅰ $Spe$Ⅰ　DNA聚合　1(2分)
(3)$Ca^{2 +}$　④(2分)　重组质粒B通过同源重组整合到了产气肠杆菌的基因组中(2分)
重难考点基因工程的应用
[深度解析]
(1)利用PCR技术扩增含有P基因上游片段和下游片段序列的融合片段N时，先在变性温度下，将融合片段N的氢键断开，解旋为单链，然后在复性温度下，两种引物分别与N的两条单链结合，最后以单链DNA为模板，在TaqDNA聚合酶的作用下延伸；常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR产物，可以根据DNA片段的大小对PCR产物进行分离和检测，从而确定是否成功扩增出目标片段。
(2)分析题图甲，根据融合片段N两端的酶切位点可知，应用$Bcl$Ⅰ和$EcoR$V切割来获得融合片段N，分析限制酶识别序列和切割位点可知限制酶$BamH$Ⅰ和$Bcl$Ⅰ是同尾酶(识别DNA分子中不同脱氧核苷酸序列，但能切割产生相同黏性末端的限制酶)，因此，应选择$BamH$Ⅰ切割质粒，为保证融合片段N正向插入，即确保重组质粒中片段N的转录方向不变，则可选择$Pst$Ⅰ或$Spe$Ⅰ切割质粒A，若选择$BamH$Ⅰ和$Pst$Ⅰ切割质粒A，产生的黏性末端如下图：
5' G
启动子 CCTAG ACCTC 终止子 3'
3' CTAGT A
由于融合片段N一端被限制酶$EcoR$V切割后产生的是平末端，故还应将$Pst$Ⅰ切割质粒A产生的黏性末端补平，但DNA聚合酶只能从DNA单链的3'端逐个连接脱氧核苷酸，上图中$Pst$Ⅰ切口处暴露的是5'端，黏性末端不能被补平，因此，不能选择限制酶$Pst$Ⅰ切割质粒A；若选择$BamH$Ⅰ和$Spe$Ⅰ切割质粒A，产生的黏性末端如下图：
5' G GATCT
启动子 CCTAGT 片段N CTAGATCA 终止子 3'
3' C CTAGAG
上图中$Spe$Ⅰ切口处暴露的是3'端，DNA聚合酶能将黏性末端补平，综上分析，应选择$BamH$Ⅰ和$Spe$Ⅰ切割质粒A，且需要DNA聚合酶将质粒A被$Spe$Ⅰ切割产生的黏性末端补平；构建重组质粒B的局部片段如下图：
5' GGATCA—GATCTAGT—
启动子 CCTAGT 片段N CTAGATCA—终止子 3'
由于$BamH$Ⅰ与$Bcl$Ⅰ是同尾酶，两者产生的黏性末端连接后形成的序列不能再被$BamH$Ⅰ或$Bcl$Ⅰ识别和切割，故重组质粒B上无限制酶$BamH$Ⅰ识别序列，但含一个限制酶$Sma$Ⅰ的识别序列，且重组质粒B为环状DNA分子，
因此，用限制酶$Sma$Ⅰ和$BamH$Ⅰ对重组质粒B进行完全酶切后，可得到一个DNA片段，电泳可得到1条条带。
(3)一般先用$Ca^{2 +}$处理产气肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，有利于重组质粒导入其中；利用重组质粒B和产气肠杆菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对P基因进行敲除，敲除后的P基因将被有关的酶降解，P基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，交换后，用题图乙中的引物1和2进行PCR扩增，检测结果如题图丙所示，其中菌落④为P基因敲除株，因为其中检测到的DNA片段(上游序列600bp + 下游序列600bp)大小约为1200bp，检测结果中菌落③的DNA片段大小约为7000bp，远大于重组质粒B和产气肠杆菌DNA中两引物之间片段的大小，原因可能是重组质粒B通过同源重组整合到了产气肠杆菌的基因组中。
拆招式超详解
回归教材人教版选择性必修3P77PCR技术
定义：聚合酶链式反应的缩写，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术
原理：DNA半保留复制
条件：模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等
扩增方向：DNA合成方向总是沿子链的5'端到3'端
引物：是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸
目的：短时间内大量扩增目的基因