《2026年新高考5年真题高中生物全一册通用版广东专版》

21. (11分)大肠杆菌是重要工业菌株之一,其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量,使细胞适配不同阶段的生产需求,研究者设计了两种质粒,并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白,测试质粒功能。请回答下列问题:
(1)研究者首先构建质粒①(图1)用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2,将质粒导入感受态细胞后,在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况,结合PCR及_______检测,筛选获得重组菌株W1。

注:P_(cso)为大肠杆菌内源启动子,在细胞快速生长期开启基因转录,但进入生长稳定期后即停止基因转录;SsrA基因编码SsrA短肽;C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源性蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解。
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养,定时取样检测培养液中细胞密度,方法有_______(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度,其作用是_______。培养结果(图2)表明,进入生长稳定期后荧光强度快速下降,原因是_______。

(3)研究者选用启动子P_X、X基因(编码阻遏蛋白X,阻遏P_X开启转录),重新构建质粒②(图1),导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养,W2的生长趋势不变,培养期间荧光强度的变化趋势为_______。

(4)莽草酸是一种重要工业化学品,其胞内合成代谢途径见图3。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱,且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物,因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累,利用上述两种质粒的调控功能,结合野生型菌株遗传物质的改造,提出重组生产菌株构建思路:_______。

答案：
21.参考答案
(1)荧光强度
(2)显微镜直接计数法 排除培养基自身荧光对实验结果的影响 进入生长稳定期后，启动子P₆₀₀停止驱动mKate2 - SsrA基因的转录，C - 末端带SsrA短肽的mKate2合成停止，但大肠杆菌内源蛋白酶系统仍在特异性识别并降解该荧光蛋白，从而使荧光强度快速下降
(3)快速生长期无荧光，生长稳定期出现荧光且荧光强度随培养时间逐渐增强
(4)先敲除野生型菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，将两个质粒导入敲除酶B基因的菌株中
命题意图本题主要考查基因工程的相关知识，意在考查考生的理解能力、获取信息的能力、实验与探究能力和综合运用能力。
解题思路
(1)利用PCR技术可检测目的基因是否导入成功，依据是否出现红色荧光和红色荧光强度可检测目的基因是否成功表达及表达量。
(2)定时取样检测培养液中细胞密度常用显微镜直接计数法。由于该实验需要检测菌体的荧光强度，因此需在实验前检测液体培养基的荧光强度，以排除培养基自身含有的某些物质可能发出荧光而引起的实验误差。在W1快速生长期，P₆₀₀驱动mKate2 - SsrA基因转录，可合成C - 末端带SsrA短肽的mKate2，使菌体发出红色荧光；进入生长稳定期后，P₆₀₀停止驱动mKate2 - SsrA基因的转录，荧光蛋白不能合成，且因mKate2的C - 末端带有SsrA短肽，会被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解，导致W1进入生长稳定期后荧光强度快速下降。
(3)在W2快速生长期，PG启动子驱动X - SsrA基因转录，X - SsrA基因编码的C - 末端带有SsrA短肽的阻遏蛋白X阻遏Px开启转录，mKate2基因无法表达，故细胞快速生长期无荧光；进入生长稳定期后，P₆₀₀启动子停止驱动X - SsrA基因转录，且C - 末端带有SsrA短肽的阻遏蛋白X被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，逐渐解除对Px的抑制作用，Px开启mKate2基因的转录，合成mKate2，培养基出现荧光，且随培养时间增加，荧光强度逐渐增强。
(4)重组生产菌株构建思路如下，先敲除野生型菌株中的酶B基因，再向该菌株中导入2个质粒，如图：

处于快速生长期时，质粒①合成C - 末端带SsrA短肽的酶B，质粒②酶A基因的表达被抑制（避免合成过多酶A造成物质和能量浪费），质粒①合成的酶B和敲除酶B基因的菌株自身的酶A基因表达的酶A共同合成细胞生长必需物质，满足菌株快速生长的需求。进入生长稳定期后，C - 末端带SsrA短肽的酶B和阻遏蛋白X被降解，质粒②酶A基因表达，合成酶A，与菌株原有酶A基因表达的酶A，共同快速合成莽草酸，以改进酶A活性弱造成的莽草酸合成速率慢的问题；此外，生长稳定期菌株因不能合成酶B且前期产生的酶B被降解，莽草酸难以转化为细胞生长必需物，可实现在生长稳定期的细胞内莽草酸的大量积累。