《2026年薪火金卷高考仿真模拟卷生物》

21. (10 分)CRISPR/Cas9 基因编辑技术可以按照人们的意愿精准剪切、改变任意靶基因的遗传信息,从而达到基因定点敲除、插入、突变的目的。在该基因编辑技术中,sgRNA 是根据靶基因设计的引导 RNA,准确引导 Cas9 切割与 sgRNA 配对的靶基因 DNA 序列。请回答下列问题:
(1) Cas9 可准确切割与 sgRNA 配对的靶基因 DNA 序列,由此可见,Cas9 在功能上属于限制酶,该过程体现了酶具有专一性;此外,Cas9 可准确切割靶基因 DNA 序列还依赖于 sgRNA 与靶基因 DNA 序列之间的碱基互补配对。
(2) sgRNA 是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列,由 23 个连续的碱基组成。研究发现,sgRNA 有时会出现脱靶问题,试分析其原因可能是sgRNA序列过短,易与靶基因以外的DNA序列互补配对而脱靶;解决措施是适当增加sgRNA的长度,提高其与靶基因识别的特异性。
(3) 为了实现某基因的特异性敲除,如图 1 所示,科学家将含有 3 个不同的但靶向相同基因的 sgRNA 编码基因的重组质粒组装到具有特殊元件的载体上,形成新的重组质粒。
注:eflap 是能够驱动基因广泛表达的启动子;EGFP 是增强型绿色荧光蛋白基因;I-Sec I 是归位内切酶,可将质粒随机插入目标生物的基因组中。
理论上,一个 sgRNA 便能实现靶基因的敲除,请分析构建图 1 所示重组质粒的优势:只构建一个表达载体即可,能准确插入目标生物基因组中;能通过绿色荧光进行筛选(答出两点)。
(4) 为筛选特定 D 基因“敲除”的果蝇,在 D 基因的 DNA 断裂位点插入绿色荧光蛋白基因(EGFP)需构建携带有绿色荧光蛋白基因的供体质粒。把 EGFP 基因和 His 标签基因(His 标签基因由 6 个组氨酸组成)连接起来构建融合基因并构建重组质粒,图 2 为载体、EGFP 基因的结构、不同限制酶的识别序列及切割位点,欲将标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端,已知组氨酸的密码子为 CAU,起始密码子为 AUG。
① 写出 His 基因模板链的碱基序列:5'-ATGATGATGATGATGATGCAT-3'。
② 为构建融合基因并将其插入载体,科研人员设计了一对与 EGFP 基因编码区两端序列互补配对的引物,设计时需在引物A(填“A”或“B”)的 5'端增加相应的限制酶识别序列和 His 基因的编码序列,请写出该引物开头的 12 个碱基序列:5'-CAATTGATGCAT-3'。

答案： 解析
(1)Cas9可准确切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列,Cas9在功能上属于限制酶,该过程体现了酶具有专一性;此外,Cas9可准确切割靶基因DNA序列还依赖于sgRNA与靶基因DNA序列之间的碱基互补配对。
(2)sgRNA是人工合成的一段能与靶基因互补配对的特殊序列,由23个连续的碱基组成。由于sgRNA序列过短,易与靶基因以外的DNA序列互补配对而脱靶,可以通过适当增加sgRNA的长度,提高其与靶基因识别的特异性来解决这个问题。
(3)由图1可知,EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因;I-SecⅠ是归位内切酶,可将质粒随机插入目标生物的基因组中,理论上,一个sgRNA便能实现靶基因的敲除,构建图1所示重组质粒的优势有:只构建一个表达载体即可,能准确插入目标生物基因组中,能通过绿色荧光进行筛选等。
(4)已知His标签基因由6个组氨酸组成,组氨酸的密码子为CAU,起始密码子为AUG,所以His基因模板链的碱基序列为:5′-ATGATGATGATGATGATGCAT-3′;设计与EGFP基因编码区两端序列互补配对的引物时要保证限制酶切割位点不能破坏EGFP基因,且标签基因连接在绿色荧光蛋白基因(EGFP)编码区的首端,故需在引物A的5′端增加相应的限制酶识别序列和His基因的编码序列,由图2分析可知,选择MunⅠ限制酶,结合组氨酸的密码子为CAU,起始密码子为AUG,引物序列为:5′-CAATTGATGCAT-3′。
答案
(1)限制 专一 碱基互补配对
(2)sgRNA序列过短,易与靶基因以外的DNA序列互补配对而脱靶 适当增加sgRNA的长度,提高其与靶基因识别的特异性
(3)只构建一个表达载体即可,能准确插入目标生物基因组中;能通过绿色荧光进行筛选
(4)①ATGATGATGATGATGATGCAT
②A CAATTGATGCAT