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【题目】乙烯具有促进果实成熟的作用，ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞合成乙烯的两个关键酶。利用反义DNA技术（原理如图1），可以抑制这两个基因的表达，从而使番茄具有耐储存、宜运输的优点。图2为融合ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因的反义表达载体的结构示意图。
（1）图2中的2A11为特异性启动子，则2A11应在番茄的 ____________（器官）中表达。
（2）从番茄成熟果实中提取 ___________为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，以进行拼接构成融合基因并扩增。
（3）合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，ACC合成酶基因两端含SacⅠ和XbaⅠ的酶切位点，用限制酶____________对上述两个基因进行酶切，再串联成融合基因，相应的Ti质粒应用限制酶 _______________进行切割，确保融合基因能够插入载体中。
（4）为了实现图1中反义基因的效果，应将融合基因 _______（正向/反向）插入在启动子 2A11 的下游即可构成反义融合基因。将表达载体与农杆菌菌液混合后，接种在含有___的培养基中，可筛选出含有反义融合基因的农杆菌，再利用农杆菌转化法获得转基因番茄。
（5）在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时，____________（填“能”/“不能”）用放射性物质标记的ACC氧化（合成）酶基因片段做探针进行检测，理由是____________。
【答案】果实 RNA Xbal BamHl和Sacl 反向 卡那霉素 不能 番茄细胞内本来存在ACC合成酶基因，能与ACC合成酶基因探针发生分子杂交
【解析】
分析题意和题图：番茄细胞中原有靶基因控制合成的ACC氧化酶和ACC合成酶是番茄细胞合成乙烯的两个关键酶。图1所示为反义基因转录成的RNA可与靶基因转录出的mRNA形成RNA双链，使靶mRNA不能与核糖体结合或被RNA酶降解，从而阻止了ACC氧化酶和ACC合成酶的合成，影响细胞中乙烯的合成，使番茄具有耐储存、宜运输的优点。图2所示的基因表达载体的组成包括复制原点、启动子、终止子、标记基因和目的基因，目的基因插入点在启动子和终止子之间。
（1）乙烯具有促进果实成熟的作用，因此图2中的2A11为特异性启动子，则2A11应在番茄的果实中表达。
（2）从番茄成熟果实中提取RNA为模板，利用反转录法合成ACC氧化酶基因和ACC合成酶基因，以进行拼接构成融合基因并扩增。
（3）合成出的ACC氧化酶基因两端分别含限制酶BamHⅠ和XbaⅠ的酶切位点，ACC合成酶基因两端含SacⅠ和XbaⅠ的酶切位点，要将两个基因融合，需用同一种限制酶即XbaⅠ酶对上述两个基因进行酶切，再用DNA连接酶串联成融合基因，这样融合基因上有三个限制酶切点：BamHⅠ、XbaⅠ、SacⅠ，其中限制酶BamHⅠ、SacⅠ分别位于融合基因的两端，因此相应的Ti质粒应用限制酶BamHl和Sacl进行切割，确保融合基因能够插入载体中。
（4）反义融合基因是由番茄果实细胞中的靶基因转录出的mRNA反转录形成的，因此为了实现图1中反义基因的效果，应将融合基因反向插入在启动子 2A11 的下游即可构成反义融合基因。将表达载体与农杆菌菌液混合后，接种在含有卡那霉素的培养基中，可筛选出含有反义融合基因的农杆菌，再利用农杆菌转化法获得转基因番茄。
（5）在检测番茄细胞中是否存在反义融合基因时，因为番茄细胞内本来存在ACC合成酶基因，能与ACC合成酶基因探针发生分子杂交，所以不能用放射性物质标记的ACC氧化（合成）酶基因片段做探针进行检测。
