Question

【题目】发根农杆菌的Ri质粒是一种植物遗传转化系统，其有3个功能区：①T-DNA区是Ri质粒上唯一整合到植物基因组上的DNA片段；②Vir毒性蛋白区是发根农杆菌实现高效侵染所必需的区域；③Ori区即复制起始区与功能代谢区。常用的质粒载体pCAMBIA1301在大肠杆菌和发根农杆菌中都能生存和克隆，并且自身携带潮霉素抗性基因以及可以替换T-DNA的DNA片段，经处理后质粒pCAMBIA1301也可具备T-DNA。部分转化过程如图所示。

请回答下列问题：

（1）限制性核酸内切酶能识别图中LB和RB的酶切位点，并能使1个pCAMBIA1301质粒的_____个磷酸二酯键断开。

（2）应用过程中，将目的片段插入到pCAMBIA1301质粒的_______________中，再将构建好的重组质粒转入发根农杆菌细胞中。要确定重组质粒是否被成功导入发根农杆菌，可在培养发根农杆菌一段时间后，利用pCAMBIA1301上自身携带的_____________进行鉴定，也可利用基因探针通过_________________技术进行检测。

（3）可分别用70%乙醇和_________________溶液浸泡处理植物组织，并使其脱分化形成愈伤组织，再用重组发根农杆菌对其进行侵染，之后进行脱菌培养，然后以适当配比的________________________诱导，最终可获得转基因植株。

（4）图中Ri质粒上的T-DNA片段有缺损，因此无法被转化至植物细胞内，但Ri质粒上的__________仍可对侵染过程起到辅助激活作用。若Ri质粒结构完整，其功能类似于根瘤农杆菌中的_______________。

Answer 1

【答案】4 T-DNA 潮霉素抗性基因 DNA分子杂交 5%次氯酸钠 营养物质和生长调节剂 Vir毒性蛋白区 Ti质粒

【解析】

基因工程的操作步骤：

1.目的基因的获取方法：（1）从基因文库中获取；（2）PCR扩增技术；（3）人工合成法。

2. 基因表达载体的构建：①过程：用同一种限制酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶将目的基因和运载体连接形成重组DNA分子。②目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在并且可以遗传给下一代并表达和发挥作用。③基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。

（1）启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始；

（2）终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束；

（3）标记基因便于目的基因的鉴定和筛选。

3.将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（1）农杆菌的特点：在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。农杆菌的Ti质粒上的T－DNA可转移到受体细胞，并且整合到染色体的DNA上。根据这一特点，如果将目的基因转移到Ti质粒的T－DNA上，通过农杆菌的转化作用，可以使目的基因进入植物细胞，并将其插入到植物细胞染色体的DNA上。

4.目的基因的检测与鉴定：（1）分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术．（2）个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

（1）限制酶能够识别双链DNA分子某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断裂，因此限制性核酸内切酶能识别图中LB和RB的酶切位点，在pCAMBIA1301质粒上切2个切口，使1个pCAMBIA1301质粒的4个磷酸二酯键断开。

（2）根据题意可知，经处理后质粒pCAMBIA1301也可具备T-DNA，将目的基因插入到T-DNA中，可以在T-DNA的作用下转移到受体细胞内染色体的DNA上，要确定重组质粒是否被成功导入发根农杆菌，可在培养发根农杆菌一段时间后，pCAMBIA1301上自身携带的潮霉素抗性基因属于标记基因，标记基因的作用是可以对重组DNA进行鉴定和选择，也可在分子水平上利用基因探针通过DNA分子杂交技术，根据杂交带的有无进行检测发根农杆菌细胞内的DNA上有无目的基因的存在。

（3）在植物组织培养过程中，对外植体可分别用70%乙醇和5%次氯酸钠溶液浸泡处理，并使其脱分化形成愈伤组织，再用重组发根农杆菌对其进行侵染，之后进行脱菌培养，然后以适当配比的营养物质和生长调节剂（生长素类和细胞分裂素类）诱导，最终可获得转基因植株。

（4）根据题意可知，图中Ri质粒上有3个功能区：①T-DNA区是Ri质粒上唯一整合到植物基因组上的DNA片段；②Vir毒性蛋白区是发根农杆菌实现高效侵染所必需的区域；③Ori区即复制起始区与功能代谢区。如果Ri质粒上的T-DNA片段有缺损，因此无法被转化至植物细胞内，但Ri质粒上的Vir毒性蛋白区是发根农杆菌实现高效侵染所必需的区域，仍可对侵染过程起到辅助激活作用。若Ri质粒结构完整，其功能类似于根瘤农杆菌中的Ti质粒。