《2026年高中必刷题高中生物选择性必修第三册人教版》

4. [天津四校 2025 高二联考]我国科学家尝试构建地衣芽孢杆菌基因编辑系统，并通过将外源$vgb$基因定向插入$19T - pflB$质粒中对该系统进行初步验证，主要过程如图 1。请回答下列问题。

(1)图 1 中步骤①利用已构建的质粒$19T - pflB$，通过反向 PCR 获得左右同源片段，除图 1 中已有的组分外，还应添加缓冲液(含$Mg^{2+}$)、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶(答两点)等。如表为$pflB$基因序列和设计的相关引物，可选用的引物是①④(填编号)。

注：下划线标注为$BamH$Ⅰ识别序列($5' - G↓GATCC - 3'$)和$Pst$Ⅰ识别序列($5' - CTGCA↓G - 3'$)
(2)图 1 中步骤②双酶切时，需使用的限制酶 a 和限制酶 b 分别是SmaⅠ和XhoⅠ，影响 DNA 连接酶反应速率的因素有反应体系的温度、pH、酶浓度和DNA片段浓度、DNA片段末端类型(答出两点)等。

(3)图 2 是质粒$PNZTK - PFTF - vgb$转入地衣芽孢杆菌后，将目的基因插入基因组的过程示意图。
将受体菌接种在含四环素和不含(填“含”或“不含”)卡那霉素的培养基中培养一段时间后，因没有选择压力，会导致发生双交换的质粒丢失。挑取一定数量的单菌落，接种到含四环素的培养基上，并一一对应接种到含卡那霉素的培养基上，实验结果如图 3 所示。其中在两种培养基中均能生长的菌株是只发生单交换或未发生交换的受体菌。
(4)科学家通过分析$vgb$基因在重组菌株及原始菌株中的表达水平验证该基因编辑系统。

分

析

时需要以$rpsE$基因(核糖体 S5 蛋白基因)为参照，该基因表达的特点是在细胞中的表达水平相对恒定。

答案： 4.
(1)四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶　①④
(2)SmaⅠ　XhoⅠ　DNA片段浓度、DNA片段末端类型
(3)不含　未发生交换
(4)在细胞中的表达水平相对恒定
[解析]
(1)PCR反应除了图1中已有的组分外，还需要添加缓冲液(含Mg²⁺)、耐高温的DNA聚合酶(用于催化DNA的合成)、四种脱氧核苷酸(原料)。PCR扩增时，引物需要与模板链进行碱基互补配对，且引物的延伸方向是5′→3′，分析pflB基因两端的序列和各引物序列，①中5′端含有BamHⅠ识别序列，且其大部分碱基序列能与pflB基因的一条链的5′端部分序列互补配对；④中5′端含有PstⅠ识别序列，且其大部分碱基序列能与pflB基因的另一条链的5′端部分序列互补配对，所以可选用的引物是①④。
(2)观察图1可知，要将外源vgb基因定向插入I19T - pflB质粒中，构建重组质粒，需要用与切割含目的基因的DNA片段相同的限制酶切割质粒，由步骤①可知，pflB基因两端具有SmaⅠ和XhoⅠ的酶切位点，步骤②双酶切时，是要将Kanᴿ插入pflB - L - pflB - R片段的外侧，需使用的限制酶a和限制酶b分别是SmaⅠ和XhoⅠ。影响DNA连接酶反应速率的因素有反应体系的温度、pH、酶浓度、底物浓度、DNA片段末端类型等，即DNA片段的浓度，DNA连接酶催化的是DNA片段之间的连接反应，底物浓度会影响反应速率。
(3)因为没有选择压力会导致发生双交换的质粒丢失，而发生双交换的重组菌含有四环素抗性基因但不含卡那霉素抗性基因，所以受体菌应接种在含四环素和不含卡那霉素的培养基中培养。只发生单交换会使受体菌含有四环素抗性和卡那霉素抗性，另外未发生交换的受体菌也对四环素和卡那霉素有抗性，所以在两种培养基中均能生长的菌株是只发生单交换或未发生交换的受体菌。
(4)rpsE基因是核糖体S5蛋白基因，核糖体是细胞进行蛋白质合成的场所，在细胞中的表达相对稳定，即该基因表达的特点是在细胞中的表达水平相对恒定。

5. [山东青岛 2025 高二期中]基因敲除又称基因打靶，其原理如图所示：将构建好的打靶质粒导入特定细胞，打靶质粒上的$A'$、$B'$序列分别与细胞基因组 DNA 上的 A、B 序列发生交换(同源重组)，使得目的基因被阳性标记基因替换，从而实现目的基因的敲除。已知同源重组的发生概率较低，也可能偶尔发生非同源重组(此时阳性和阴性标记基因均插入基因组 DNA，而目的基因也仍在基因组 DNA 上)导致基因敲除失败，阳性和阴性标记基因均只有位于基因组 DNA 上时才能表达。

(1)将打靶质粒导入特定动物细胞的方法是显微注射法。动物细胞减数分裂过程中，可能发生类似上述阳性标记基因替换目的基因的过程，推测应在减数第一次分裂前期(填时期)。
(2)现有两种标记基因：新霉素抗性基因($neo^{R}$)和疱疹病毒胸苷激酶基因($HSV - tk$)。导入新霉素抗性基因后，动物细胞对 G418(氨基糖苷类抗生素)有抗性，未导入的没有抗性；$HSV - tk$的表达产物可使无毒的丙氧鸟苷转变为有毒的核苷酸，从而杀死细胞。在设计打靶质粒时，应以新霉素抗性基因(neoᴿ)作为阳性标记基因，以疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV - tk)作为阴性标记基因。在培养基中添加G418和丙氧鸟苷，以此筛选出基因敲除成功的细胞。
(3)成纤维生长因子 1(FGF1)是一种内源性蛋白类激素，研究表明 FGF1 具有降低血糖的作用。FGF1 可能通过提升胰岛素敏感性降低血糖水平但不能直接降低血糖水平，也可能具有直接降低血糖水平的作用。欲设计实验探究 FGF1 降低血糖浓度的原理，需敲除正常小鼠的胰岛素基因和FGF1基因作为模型小鼠进行实验。

答案： 5.
(1)显微注射法　减数第一次分裂前期
(2)新霉素抗性基因(neoᴿ)　疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV - tk)　G418和丙氧鸟苷
(3)胰岛素基因和FGF1基因
[解析]
(1)将质粒导入动物细胞常用显微注射法。阳性标记基因替换目的基因的过程属于基因重组(同源重组)，图中阳性标记基因替换目的基因，类似于减数第一次分裂前期的染色体互换。
(2)根据题干信息，新霉素抗性基因(neoᴿ)可使动物细胞获得对G418的抗性，应以新霉素抗性基因作为阳性标记基因，目的基因是被敲除的基因，操作后目的基因应该与阴性标记基因连接在打靶质粒上(无法表达)，故以疱疹病毒胸苷激酶基因HSV - tk作为阴性标记基因，便于对发生非同源重组的基因组DNA进行筛选。由于导入新霉素抗性基因后，动物细胞对G418(氨基糖苷类抗生素)有抗性，未导入的没有抗性，且HSV - tk的表达产物可使无毒的丙氧鸟苷转变为有毒的核苷酸，从而杀死细胞，因此在培养基中添加G418和丙氧鸟苷，以此筛选出基因敲除成功的细胞。
(3)FGF1可能通过提升胰岛素敏感性降低血糖水平但不能直接降低血糖水平，也可能具有直接降低血糖水平的作用，若设计实验探究FGF1降低血糖浓度的原理，需敲除正常小鼠的胰岛素基因和FGF1基因作为模型小鼠进行实验。对模型小鼠进行FGF1和胰岛素处理，研究FGF1的作用。