《2026年高中必刷题高中生物选择性必修第三册人教版》

4. [安徽阜阳2025高二月考]农杆菌Ti质粒上的T-DNA(序列已知)可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图1中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板，利用PCR技术扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列，进一步分析可确定T-DNA插入的具体位置。T-DNA的序列如图2所示，虚线处省略了部分核苷酸序列。已知*Sal*Ⅰ酶的识别序列为5’-G↓TCGAC-3’。回答下列问题：

(1)PCR技术扩增时起关键作用的酶是耐高温的DNA聚合酶，其作用是将游离的脱氧核苷酸连到引物的3'端(或催化合成子链)。
(2)扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列时，需要先根据T−DNA两端已知的碱基序列设计两种特异性引物序列，利用图中的引物①④组合可扩增出T-DNA两侧的未知序列。
(3)若只使用一种引物，通过PCR技术制备与T-DNA的b链相同的单链作为某些检测的探针，则所选择引物由5’→3’的前5个碱基序列为5’−CTGTC−3’。
(4)对PCR产物测序，经分析得到了图1中的未知序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，可能正确的是A。
A. 5’-GTCGACCAC……ATGTCGA-3’
B. 5’-AATTCCATG……CTGAATT-3’
C. 5’-GCAATGCGT……TCGGGA A-3’
D. 5’-TTGATACGC……CGAGTAC-3’
(5)PCR技术扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列后，扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。

答案： 4.
(1)耐高温的DNA聚合酶将游离的脱氧核苷酸连到引物的3'端(或催化合成子链)
(2)T−DNA两端已知的碱基序列①④
(3)5'−CTGTC−3'
(4)A
(5)琼脂糖凝胶电泳
[解析]
(1)PCR技术需要在高温条件下进行，故进行PCR扩增需要耐高温的DNA聚合酶。该酶用于子链延伸,将游离的脱氧核苷酸连到引物的3'端。
(2)扩增出T−DNA插入位置两侧的未知序列时，需要先根据T−DNA两端已知的碱基序列设计两种特异性引物序列。PCR扩增时，子链沿引物的3'端延伸，故利用图中的引物①④组合可扩增出T−DNA两侧的未知序列。
(3)通过PCR技术制备与T−DNA的b链相同的单链作为某些检测的探针，则需以a链为模板,引物5'→3'的序列与b链相同,故引物由5'→3'的前5个碱基序列为5'−CTGTC−3'。
(4)由于SalⅠ的识别序列为5'−G↓TCGAC−3',则扩增的未知序列中应该含有相关序列,A符合题意。
(5)PCR扩增产物一般通过琼脂糖凝胶电泳技术进行鉴定。

5. [湖南师大附中2025高二期中]为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，科研人员运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。

(1)分别进行PCR扩增片段F₁与片段F₂时，配制的两个反应体系中不同的有模板、引物。
(2)有关基因序列如图2所示，引物F₂-F、F₁-R应在下列选项中分别选用C、D。

A. 5’-ATGGTG……CAACCA-3’
B. 5’-TGGTTG……CACCAT-3’
C. 5’-GACGAG……CTGCAG-3’
D. 5’-CTGCAG……CTCGTC-3’
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。与传统构建重组载体的方法相比，这一操作无需使用的酶主要有限制酶、DNA连接酶。
(4)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F₁-F和F₂-R进行了PCR扩增，质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有P3、P4。

(5)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是电泳只能检测DNA的大小(或长度),不能检测具体的序列。

答案： 5.
(1)模板、引物
(2)C、D
(3)限制酶、DNA连接酶
(4)P3、P4
(5)电泳只能检测DNA的大小(或长度),不能检测具体的序列
[解析]
(1)PCR反应所需的基本条件:引物、耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸、模板和缓冲液(其中含$Mg^{2+})$等。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有模板和引物。
(2)由图1可知,引物F2−F用于扩增F2片段,引物F1−R用于扩增F1片段。C项中5'−GACGAG−3'与EGFP基因右侧部分序列相同,5'−CTGCAG−3'与AnB1基因左侧部分序列相同,因此引物F2−F应选用C。D项中5'−CTGCAG−3'能与AnB1基因左侧部分序列进行碱基互补配对,5'−CTCGTC−3'能与EGFP基因右侧部分序列进行碱基互补配对,因此引物F1−R应选用D。
(3)传统构建重组载体需要使用限制酶切割载体、目的基因，使其具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶将目的基因和载体连接成重组载体。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下可形成环化质粒，不需要使用限制酶和DNA连接酶。
(4)EGFP长度为720bp,AnB1长度为390bp,二者之和为720bp + 390bp = 1110bp,用引物F1−F和F2−R进行了PCR扩增，扩增产物的大小应接近1110bp,根据图3中结果判断,可以舍弃的质粒有P3、P4。
(5)电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小,无法确定待检测DNA分子的碱基序列,因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认。